Como quantificar géis de eletroforese por imagem

A eletroforese é uma técnica essencial usada para a clonagem de genes e para outros experimentos avançados em biologia molecular. Os cientistas usam rotineiramente a eletroforese para uma única finalidade, para separar componentes moleculares individuais do DNA, RNA ou proteínas em um gel plano. Este procedimento permite que os cientistas determinem a quantidade de moléculas de um determinado tipo que está presente em uma amostra e qual o tamanho dessas moléculas. Para fazer isso, a amostra pode migrar ao longo do gel, durante a migração é dividida em bandas de tamanhos diferentes em pontos bem definidos no gel. Finalmente, o gel contendo as moléculas que migraram é fotografado. Esta é a imagem que deve ser quantificada para analisar os dados.

Quantificação das imagens em gel de eletroforese

Escolha um software de análise de imagem adequado. Isso é obrigatório, portanto, o acesso ao software de densitometria, como Kodak DirectView EVP Plus e Carestream Molecular Imaging, deve ser obtido com antecedência. Por outro lado, também estão disponíveis softwares mais econômicos (por exemplo, Adobe Photoshop) e de uso livre projetados especificamente para a análise de imagens científicas (por exemplo, ImageJ). O ImageJ é um pacote gratuito que possui todas as funções, é comumente usado em laboratórios de biologia molecular e é fácil de operar. Para os fins deste artigo, usaremos o ImageJ como exemplo. No entanto, os princípios de cada etapa são universais e facilmente aplicáveis ​​a todos os tipos de software de análise de imagem.

Converta a imagem em um formato utilizável. O ImageJ é compatível com muitos equipamentos de imagem e câmeras usadas em laboratórios que realizam eletroforese. No entanto, é uma prática comum criar .JPEG, .TIFF ou outros formatos universais de imagem para analisar.

Importe as imagens para o software de análise de imagens. Alguns softwares de análise de imagens fazem com que as imagens importadas tenham uma resolução mais baixa, um contraste diferente e outros problemas de qualidade da imagem. Portanto, é uma boa idéia importar todos os formatos e escolher aquele com a mais alta qualidade no software. escolhido O ImageJ não tem problemas de resolução e mantém a qualidade dos dados brutos.

Converta a cor da imagem em “escala de cinza”. No ImageJ, selecione a guia “imagem” e, no menu, clique em “escala de cinza”.

Define os parâmetros de medição apropriados para a análise. Na guia Analisar, selecione “Definir medidas” e, em seguida, selecione as caixas “Área”, “valor médio do cinza” e “Densidade integrada” no menu suspenso.

Defina a escala correta para a análise. No software de amostra, clique em “Analisar”, depois em “Definir a escala” e, no espaço para a unidade de comprimento, digite “pixels”.

Invista nas cores para maior clareza visual. Na guia Editar, selecione “Inverter” para que as áreas claras pareçam escuras e vice-versa.

Selecione as bandas desejadas na imagem. Na paleta de ferramentas, selecione a ferramenta “Seleção livre” e arraste o ponteiro do mouse ao longo da borda da primeira banda ou da banda do experimento de controle. Selecione apenas a banda e evite todas as sombras de fundo, que são essencialmente ruídos.

Meça (ou seja, quantifique) a área selecionada. Pressione “m” e na janela de resultados exibida, você encontrará medidas de densidade integrada, área, valor médio de cinza, etc. Repita as etapas anteriores até ter medido todas as bandas. Em seguida, copie todos os valores em uma planilha. As imagens quantizadas estão prontas para análise de dados no programa de planilhas.

Referências

 

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